蛋白质组学是指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴学科，是对基因组表达的整套蛋白质的分析。目前基于质谱的蛋白质组学分析中应用最广泛的策略是自下而上法(bottom-up)，也称为“鸟枪法”（shotgun）。蛋白质组学样本的处理的基本流程是：收集样本，提取总蛋白，将等量蛋白酶解成肽段，送入质谱检测。此外需要根据实验需求，对肽段进行标记或者修饰富集，经HPLC分级分离后送入质谱采集数据。整个过程中，样本的收集处理是基础，是获得优质数据的基石；生物有机质谱检测是技术核心，是获得优质数据的保障；生物信息学是手段，可以最大化的利用获得的质谱数据，做后续的验证和分析。

　　1. 蛋白提取

　　首先需要尽量破碎样本，释放出更多的蛋白质，破碎细胞的方法比较多，常用的是去污剂裂解、超声、研磨、机械匀浆等。接下来“充分溶解蛋白”尤为重要，如果蛋白没有充分溶解，能提取到的蛋白就会很少，达不到研究目的。为了增加样品溶解性，可以加入裂解液，利用其中的SDS、SDC、NP40、Triton-X100、Urea等去垢剂或表面活性剂。消除蛋白质疏水基团之间的相互作用，蛋白质在其PI值处的溶解性，促进蛋白质的释放。

　　破碎样品和溶解样品的过程中，为了减少人为操作引入的修饰，通常会准备大量的冰，进行冰上的操作，并加入适量的蛋白酶抑制剂PMSF等抑制蛋白降解。若处理过程中引入杂质过多，可以使用丙酮沉淀蛋白质、去除杂质。

　　2. 蛋白质控

　　蛋白质控的目的是检查提取到的蛋白是否满足后续实验要求。包括两个方面：蛋白质浓度测定和SDS-PAGE。利用SDS-PAGE，可以检测蛋白的提取效率，是否有污染，定量准确性以及是否存在高丰度蛋白。蛋白浓度测定常用的方法有BCA和Bradford。BCA试剂在碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，吸光强度与蛋白浓度成正比。测定其在562 nm处的吸收值。Bradford法中，考马斯亮蓝在酸性游离状态下呈棕红色，在一定的浓度范围内，蛋白质-染料复合物在波长为595 nm处的光吸收与蛋白质含量成正比，通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。

　　 

　　3. 蛋白酶解

　　通常蛋白质都是成球状的稳定状态，那么我们可以在酶解之前的蛋白样品中加入DTT，将球状蛋白中的二硫键打开，让它形成链状结构，接着加入烷基化试剂IAM，将暴露出来的巯基封闭，防止再次形成二硫键，酶解一般使用的是胰蛋白酶（Trypsin），它可以特异性的切断赖氨酸（Lys/K）和精氨酸（Arg/R）C端肽键，将蛋白酶解为适宜质谱检测的肽段长度。

　　 

　　4. 肽段除盐

　　去除杂质，伴随着整个预处理的过程。杂质都是从哪里来的呢？比如，从组织中带来的杂质，提取溶液、酶解样品中带来的盐等。我们要知道，质谱是一个非常灵敏的仪器，它检测的是多肽的质荷比。所有的盐类，以及所有会进行离子化的杂质，都会干扰到肽段的检测。所以我们会要求进入质谱之前的蛋白样品非常干净。所以我们需要进行肽段除盐，目前常使用层析法，主要原理是SDB或C18材质的层析柱可以结合待检测肽段，而盐类物质和其他一些杂质在通过层析柱的时候会流穿过去，从而达到分离和纯化肽段的目的。

　　5. 稳定同位素标记

　　iTRAQ/TMT定量蛋白质组学技术 iTRAQ(Isobaric Tag for Relative Absolute Quantitation)和TMT(Tandem Mass Tags)技术是生物学领域应用广泛的两种蛋白质标记定量技术。该技术分别通过与氨基酸末端氨基（N端）以及赖氨酸（Lysine）侧链游离氨基结合，实现对多肽的标记。其基本步骤是，将同批次待比较的肽段样品分别与不同通道的标记试剂混合反应，然后将不同标记的样品等量混合，在质谱分析时，不同样本的同一肽段标记后表现为相同的质荷比，被同时选择进行二级碎裂，产生质量不同的报告离子，通过报告离子的丰度实现不同样品间蛋白质的定量。适用于不同样本的蛋白质组定量研究。

　　为了提高标记定量的准确性，标记定量的项目通常都需要对酶解前的各个样品进行准确的蛋白浓度测定和肽段浓度测定。

　　 

　　6. HPLC分级

　　质谱仪是一种离子饱和性仪器，高丰度蛋白的存在会对低丰度蛋白的信号产生抑制，并且质谱仪反应也需要一定的时间。所以对肽段混合物进行分级，可以降低检测的难度，理论上更多的馏分（fraction）可以获得更高的样品分析深度，检测和定量到更多的肽段和蛋白。不过这种增长并不是呈线性关系的，分级的级数达到一定程度时，能鉴定到的蛋白数量的增长就会饱和。因此根据样本复杂程度，通常会将样品分级成10-30个馏分进行检测。

　　 

　　（参考文献：Chen Ding，A Fast workflow for identification and quantification of proteomes,MCP,2013,12:2370-2380）

　　总结

　　整个处理过程中，所有使用的EP管、枪头、装试剂的塑料瓶，都尽量用低吸附产品，尤其是当使用到强溶解性的溶液，普通的EP管上的材料（聚乙二醇）很容易被洗脱下来，进入样品中，并且很难洗脱掉。而聚乙二醇非常容易离子化，会在质谱里形成很强的塑料峰，甚至会完全掩盖目标肽段的峰，造成检测的失败！

　　蛋白质科学技术平台简介

　　蛋白质科学技术平台依托于中国科学院水生生物研究所分析测试中心，是具有华中地区生命科学研究特色的公共技术支撑平台。平台以“测试、分析”为运行模式，全面开展基于色谱、电泳、质谱等技术的蛋白质新技术、新方法研究与应用，为所内所外承担的重大科研课题提供技术支撑服务或开展合作研究，为国家在水环境保护、生物资源利用和人口健康保护方面的创新性研究和技术创新提供关键技术支撑。蛋白质科学技术平台在优先保障支撑研究所和区域中心成员单位的科研需求的基础上，所有大型仪器均对外开放，实现了大型仪器的合理布局、规范管理、高效共享开放、技术服务、技术培训和技术发展。平台服务的领域涉及蛋白质快速制备、分离纯化与鉴定、表达分析、大规模鉴定和定量研究、分子间相互作用等，各个方向互相支撑，完整涵盖了从蛋白质制备到蛋白质功能研究分析的技术条件保障。蛋白质科学技术平台对研究所内外服务的形式主要有仪器租用、技术开发、技术服务和检测服务。

　　平台技术设备共计16台套左右，包括：高通量组织匀浆仪、真空离心浓缩仪、分析型超速离心机、分离纯化系统、蛋白质液相色谱系统层析系统、超高效液相色谱仪、液相色谱-离子阱质谱仪、全自动蛋白酶解工作站、自动蛋白斑点切取系统、单细胞蛋白质表达定量分析系统、全自动蛋白质表达分析系统、超高分辨质谱仪（Thermo LTQ Orbitrap Elite）、四极杆轨道阱质谱仪（Q Exactive HF-X）、光散射光度计、超灵敏细胞信号转导蛋白分析系统、生物分子相互作用分析系统。

　　在本平台可进行以下研究：

　　（1）蛋白质分离、提取与纯化。

　　 

　　（2）蛋白质的凝胶电泳检测、蛋白质凝胶染色、蛋白质免疫印迹检测等；基于凝胶电泳和免疫印迹的蛋白质快速定性与定量检测。

　　 

　　（3）胶内/溶液内蛋白鉴定、修饰位点鉴定分析、非标记定量蛋白质组学分析、利用化学标记如TMT、iTRAQ的标记定量蛋白质组学分析。

　　 

　　（4）蛋白质分子间的相互作用，以及互作蛋白的筛选。

　　 

　　分析测试中心蛋白质科学技术平台服务联系方式：

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