孙媛

膜片钳技术（patch clamp techniques）是采用钳制电压或电流的方法对生物膜上离子通道的电活动进行记录的微电极技术。1989年，Blanton将脑片电生理记录与细胞的膜片钳记录结合起来，建立了脑片膜片钳记录技术（patch clamp on in vitro brain slices），这为在细胞水平研究中枢神经系统离子通道或受体在神经环路中的生理和药理学作用及其机制提供了可能性。

离体的脑组织能够在一定的温度、酸度和渗透压、通氧状态等条件下存活并保持良好的生理状态。与急性分离的或培养的神经元相比，离体脑片中的神经元更接近生理状态：基本保持了在体情况下的细胞形态，神经细胞之间及神经细胞与非神经细胞之间的很多固有联系，以及较为正常完整的突触回路、受体分布、递质释放及其信息传递等功能。

分析测试中心现有一套配备齐全的膜片钳系统（Molecular Devices Axon 700B）和振动式切片机（Leica VT1200），可高效、精密、自动化地测量脑片神经细胞等特殊细胞的生物电信号以及分析其电信号的传递与表达规律。

 

分析测试中心膜片钳系统与振动式切片机

 

膜片钳技术共有四种基本记录模式：细胞贴附记录模式、膜内面向外记录模式、膜外面向外记录模式和全细胞记录模式。其中，全细胞记录可以获得细胞膜上所有离子通道的综合特性，能够揭示细胞的电生理状态，进而为研究单细胞功能变化或细胞之间信号传递提供有力的参考信息。

脑片膜片钳全细胞记录的基本操作流程如下：

（1）制备溶液–人工脑脊液的制备和预冷，严格控制溶液渗透压和pH值。

（2）准备样本–取脑、切片并进行孵育。

（3）设置灌流系统–将脑片固定于记录浴槽中，持续灌流。

脑片的孵育与固定

 

（4）拉制玻璃微电极–使用水平程控拉制仪（Sutter P-1000）拉制玻璃电极，并抛光电极尖端。

 

玻璃电极的拉制与抛光

（5）钳制细胞–使用三维操纵器控制电极接触细胞膜，以完成高阻封接、破膜等操作。

 

全细胞记录过程中电流的变化

（6）信号采集和放大–使用双探头膜片钳放大器700B对信号进行采集和放大。

（7）信号数模转化–对模拟信号进行数字化转化（数模转换器1550A），以便对信号进行分析。

（8）数据采集和分析–使用pCLAMP 11软件，根据实验目编程不同的实验方案，以实现数据的精确测定和分析。

 

信号采集与转化流程

膜片钳技术最初开发用于记录流经细胞膜中通道蛋白的离子电流，现已成为神经科学工具的中坚力量。基于脑片膜片钳技术的细胞电生理研究案例：

     1. 细胞兴奋性研究：全细胞模式记录神经元动作电位发放（action potential，AP），记录信号指标包括动作电位频率、膜电位、阈值、峰间隔、潜伏期、波宽等指标，反映细胞整体兴奋性。

 

根据超极化、自发起搏器活动和宽动作电位（AP）产生的电压变化识别DA神经元

（Kristal T et al. PNAS, 2015）

 

2. 细胞兴奋性及抑制性突触后电流研究：全细胞模式检测微小兴奋性及抑制性突触后电流（mEPSC、mIPSC）和自发兴奋性及抑制性突触后电流（sEPSC、sIPSC）。

应激易感鼠中mPFC→LHb环路神经元突触后电流（IPSC）幅值以及频率的变化

（Song L, et al. Biological Psychiatry, 2022）

 

   3. 突触可塑性研究：全细胞模式记录长时程增强（Long-Term Potentiation，LTP）以及长时程抑制（Long-Term Depression，LTD），反映突触可塑性，学习记忆等细胞突触机制。

                 

 

嗅觉剥夺后小鼠海马脑区长时程增强（LTP）以及长时程抑制（LTD）

（An Y et al. Neurochemistry International, 2020）

分测中心膜片钳系统除了以上功能外，同时配置了钙离子成像系统，可实现钙指示剂对神经元的钙信号活动进行记录作用；光遗传调控装置是利用光敏蛋白对神经元的活动进行控制，从而实现对神经元的活动进行精准调控。这些技术是研究人员观测神经以及多种细胞活动最为直接的手段，现已发展为生命科学研究的热点与重要领域！

 

分析测试中心分子与细胞生物学技术平台简介

中国科学院水生生物研究所分子与细胞生物学技术平台是具有华中地区生命科学研究特色的公共技术支撑平台，聚集分子与细胞生命科学前沿及高端大型科研仪器设备，推动科技资源共享，为科学研究、技术开发提供强有力的技术支撑。平台具备分子、细胞、组织、活体水平的生理—生化—核酸—蛋白质分析的配套技术体系，致力于为所内、外以及周边的科研院所和企业等提供仪器共享和技术服务。主要服务项目包括：

 

      一、分子水平研究

基因表达定量分析：平台拥有5台伯乐荧光定量/CFX96Touch实时荧光定量PCR仪，实现高效、快速、均衡的扩增，可用于定量、基因表达水平分析、基因突变检测、GMO检测及产物特异性分析等多种研究领域。

二、细胞、组织水平研究

1. 流式细胞仪类

平台配有高速/超速流式细胞分选系统，可对人、鼠、鱼类、藻类细胞系、原代细胞、荧光蛋白表达细胞、肿瘤组织单细胞悬液等多种细胞样本进行常规、无菌或单克隆分选。流式细胞分析仪可进行细胞亚群、细胞因子，细胞周期、倍性、凋亡，线粒体膜电位、细胞内钙离子、活性氧检测等。

此外，量化成像分析流式细胞仪设备在传统的流式细胞术基础之上，结合了荧光显微成像技术，能对检测的每个细胞进行成像，提供超过百种量化成像参数，突破流式散点图与明场、荧光图像一一对应，获取高分辨的细胞形态和蛋白定位，完美解析细胞功能。

                            

2. 高内涵细胞成像系统在细胞水平上检测多个指标，检测范围包括：细胞计数、蛋白表达、细胞凋亡、蛋白转位、细胞活力、细胞迁移、受体内吞、细胞毒性、细胞周期和信号转导等。

3. 细胞能量代谢仪可检测悬浮细胞、贴壁细胞及组织的代谢能力，进行细胞ATP速率测定、细胞能量代谢表型检测、细胞糖酵解压力检测、细胞糖酵解速率检测、细胞线粒体压力检测、线粒体底物分析检测。

4. 转基因与基因打靶显微操作系统主要用于鱼类转基因动物模型制备、鱼卵注射、干细胞移植、组织胚胎工程、卵浆内单精子注射、极体或卵裂球活检、辅助着床等工作。

     

 

      5. 膜片钳系统和平面微电极阵列记录系统主要监测记录离体组织如脑片、心肌切片、培养的神经细胞或心肌细胞、干细胞等材料细胞膜上离子通道的离子电流或电压；测量细胞外直接相邻的局部电变化，同时并行记录多个细胞或组织位点的电生理信号。并为广大的科研人员提供接样、前处理、上机检测、数据分析一站式技术服务。

     

三、活体水平研究

活体可见光成像仪：生物发光和荧光的活体动物无损二维及三维成像，生物发光是用荧光素酶（Luciferase）基因标记细胞或DNA，和荧光技术则采用荧光报告基团（GFP、RFP、Cyt及dyes等）进行标记后，该系统直接观测和拍照活体动物体内肿瘤的生长及转移、感染性疾病发展过程、特定基因的表达等生物学过程。                                                                              

平台联系方式：

汪艳老师 Tel：027-68780783  Email：wangyan@ihb.ac.cn

孙媛老师 Tel：13260624027  Email：sunyuan@ihb.ac.cn