王敏

一、仪器介绍

Bio-Rad 公司的NGC中高压层析系统家族能够为实验室层析提供一个整体的纯化解决方案，该方案可以满足生物大分子纯化的通量需求，实现从分析至制备级的应用。

水生所分析测试中心目前具有分析级NGC Quest 10和制备级NGC Discover 10。NGC Quest 10是一个快速分离肽、核酸、蛋白和天然产物的全新液相色谱系统，其配套的色谱柱和方法模板可以进行凝胶过滤、离子交换、疏水层析、反向层析和亲和层析，适合从一般科研检验到药品质检或临床分析应用。本台仪器还配有BioFrac 分部收集器，完成样品组分的收集，可使用软件控制。NGC Quest 10可以操作各种层析技术，适合分离和纯化各种生物分子，包括天然蛋白质，重组和融合蛋白质、肽、寡核苷酸、质粒、病毒、抗生素、生物碱等等，适合操作肽图等精确分析和小量制备应用，最适于纯化设计实验。

二、性能特点

1、流量范围：0.001-10mL/min。

2、压力范围：0-25MPa，适于高压、中压分析及制备。

3、混合能力：全自动双泵系统，流速精度高，梯度重复性高。

4、波长范围：190-800nm，NGC Quest 10单波长，NGC Discover 10可实时连续检测4个波长。

5、实时 pH 监测器：2-12。

6、实时电导监测器：1μs/cm-999.9μs/cm。

7、样品自动收集器。

三、用途

快速完成纯化生物分子蛋白质、核酸、肽等，完成从实验室基础研究到整个工艺方法快速开发及放大。可以进行生物大分子的范例纯化，已知和未知蛋白质的纯化，蛋白质的结构动力学药物作用靶点研究，药物蛋白的分离，蛋白质工程药物的合成，蛋白质的定性，组织细胞中各种蛋白质在生物体中如何发展功能，基因表达产物的分离。

可以检测、分离、纯化多种生物样品，能够有效地针对各种样品：植物、动物、人类生物体，检测、纯化、分离特异性生物小分子。

四、实验检测

1、流动相准备：根据实验要求准备配套的缓冲盐系统，0.22um 滤膜抽滤，一般要求至少1L体积。

2、样品量：一次上机样品体积不多于1ml，如果体积过大可提前浓缩，样品浓度尽量偏大，减少损失。

3、检测时：样品上柱纯化前，需先滤膜过滤，少量样品可用高速离心取上清，避免样品里颗粒堵塞色谱柱，准备一次性1ml注射器。

4、样品收集：需要准备1.5ml EP管若干，提前去盖置于样品收集器中。

5、仪器维护：实验结束，仪器冲洗顺序：至少2个柱体积流动相、至少5个柱体积超纯水、至少2个柱体积20%乙醇溶液。

6、实验谱图展示：

分子筛分离纯化蛋白示意图

五、总结

1、为了避免蛋白质变性，不要对样品剧烈搅动和反复冻融。

2、缓冲溶液成分尽量模拟细胞内环。

3、为了避免蛋白质的氧化，将 0.1～1 mmol/L DTT（二硫苏糖醇）(或 β-巯基乙醇）加入到缓冲溶液中。

4、为了避免重金属对目标蛋白的破坏，将 1～10 mmol/L EDTA 金属螯合剂加入。

5、为了避免微生物生长，使用灭菌溶液。在纯化任何一种蛋白质的时候，均必须时刻对它的稳定性注意维护，使它的活性得到保护，需要牢记如下一些通用的注意事项。

6、尽可能置于冰上或者在冷库内进行操作。

7、蛋白浓度不要太稀。

8、除非是进行聚焦层。否则 pH 需要合适，防止所使用的缓冲溶液 pH 与 pI 相同，使蛋白质的沉淀得以避免。

9、使用蛋白酶抑制剂，避免蛋白酶对目标蛋白的降解；在纯化细胞中的蛋白质时，将 DNA 酶加入来使得 DNA 降解，避免 DNA 对蛋白的污染。

 

                              蛋白质科学技术平台简介

蛋白质科学技术平台依托于中国科学院水生生物研究所分析测试中心，是具有华中地区生命科学研究特色的公共技术支撑平台。平台以“测试、分析”为运行模式，全面开展基于色谱、电泳、质谱等技术的蛋白质新技术、新方法研究与应用，为所内所外承担的重大科研课题提供技术支撑服务或开展合作研究，为国家在水环境保护、生物资源利用和人口健康保护方面的创新性研究和技术创新提供关键技术支撑。蛋白质科学技术平台在优先保障支撑研究所和区域中心成员单位的科研需求的基础上，所有大型仪器均对外开放，实现了大型仪器的合理布局、规范管理、高效共享开放、技术服务、技术培训和技术发展。平台服务的领域涉及蛋白质快速制备、分离纯化与鉴定、表达分析、大规模鉴定和定量研究、分子间相互作用等，各个方向互相支撑，完整涵盖了从蛋白质制备到蛋白质功能研究分析的技术条件保障。蛋白质科学技术平台对研究所内外服务的形式主要有仪器租用、技术开发、技术服务和检测服务。

平台技术设备共计17台套左右，包括：高通量组织匀浆仪、真空离心浓缩仪、分析型超速离心机、分离纯化系统、蛋白质液相色谱系统层析系统、超高效液相色谱仪、液相色谱-离子阱质谱仪、全自动蛋白酶解工作站、自动蛋白斑点切取系统、单细胞蛋白质表达定量分析系统、全自动蛋白质表达分析系统、超高分辨质谱仪（Thermo LTQ Orbitrap Elite）、四极杆轨道阱质谱仪（Q Exactive HF-X）、高分辨飞行时间质谱仪（Sciex TripleTOF 6600+）、光散射光度计、超灵敏细胞信号转导蛋白分析系统、生物分子相互作用分析系统。

在本平台可进行以下研究：

（1）蛋白质分离、提取与纯化。

（2）蛋白质的凝胶电泳检测、蛋白质凝胶染色、蛋白质免疫印迹检测等；基于凝胶电泳和免疫印迹的蛋白质快速定性与定量检测。

                              附：蛋白质科学技术平台蛋白组学分析检测项目一览表

分析测试中心蛋白质科学技术平台服务联系方式：